Ein internationales Team von Wissenschaftlern aus den USA, Frankreich und China hat eine halbsynthetische Lebensform geschaffen. Obwohl bereits Versuche unternommen wurden, Bakterien mit modifizierter DNA zu erhalten, vermehrten sich Mikroorganismen schlecht, erforderten spezielle Wachstumsbedingungen und beseitigten schließlich die in sie eingeführten Modifikationen. "Lenta.ru" spricht über eine neue Arbeit, in der es den Forschern gelungen ist, diese Probleme zu lösen, indem sie eine Kreatur erhalten haben, die sich radikal von allem natürlichen Leben auf der Erde unterscheidet.
Vor nicht allzu langer Zeit bestand die DNA aller lebenden Organismen auf unserem Planeten aus vier Arten von Nukleotiden, die Adenin (A) oder Thymin (T) oder Guanin (G) oder Cytosin © enthielten. Strings von zehn oder Hunderten Millionen Nukleotiden bilden separate Chromosomen. Die auf Chromosomen gefundenen Gene sind im Wesentlichen lange Nukleotidsequenzen, in denen die Aminosäuresequenzen von Proteinen codiert sind. Die Kombination von drei aufeinanderfolgenden Nukleotiden (Codon oder Triplett) entspricht einer von 20 Aminosäuren. Daher verwendet das Leben einen genetischen Code aus drei Buchstaben (ATG, CGC usw.), der auf einem Alphabet aus vier Buchstaben (A, C, T, G) basiert.
Wenn eine Zelle eines Organismus ein Protein (Polypeptid) benötigt, wird das dafür kodierende Gen eingeschaltet. Letzteres ist an ein spezielles Enzym namens RNA-Polymerase gebunden, das während des Transkriptionsprozesses beginnt, der Sequenz von Nukleotiden zu folgen und eine Kopie davon in Form eines Moleküls namens Messenger-RNA (mRNA) zu erstellen. RNA ist der DNA sehr ähnlich, enthält jedoch anstelle von Thymin Uracil (U). Danach verlässt die mRNA den Zellkern und wird zu den Ribosomen geleitet, wo sie während des Translationsprozesses als Rezept für die Bildung der Aminosäurekette des Proteins dient.
Die Forscher beschlossen, den genetischen Code von Escherichia coli durch Hinzufügen von zwei zusätzlichen "Buchstaben" zu ändern. Tatsache ist, dass DNA in lebenden Organismen doppelt ist, dh durch zwei Ketten gebildet wird, die durch komplementäre Bindungen miteinander gepaart sind. Solche Bindungen werden zwischen der Base des A-Nucleotids von einem Strang und der Base des T-Nucleotids von dem anderen (ähnlich zwischen C und G) gebildet. Deshalb müssen sich die beiden neuen synthetischen Nukleotide auch komplementär paaren können. Die Wahl fiel auf dNaM und d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Ein Paar synthetischer Nukleotide wurde in ein Plasmid inseriert - ein doppelsträngiges zirkuläres DNA-Molekül, das sich getrennt vom Rest des Bakteriengenoms vermehren kann. Sie ersetzten ein Paar komplementärer Nukleotide A und T, die Teil des Laktoseoperons waren - eine Reihe von Genen, die Laktosezucker metabolisieren, und die damit verbundenen nichtkodierenden DNA-Sequenzen. Synthetische Nukleotide waren nicht in der Region enthalten, die die Polymerase in mRNA kopiert.
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Warum haben Wissenschaftler beschlossen, synthetische Nukleotide nicht direkt in das Gen einzufügen, sondern daneben? Tatsache ist, dass es sehr schwierig ist, ein Gen auf diese Weise so zu verändern, dass es funktionsfähig bleibt. Schließlich müssen Sie dazu die resultierenden neuen Codons an eine beliebige Aminosäure binden. Dazu ist es wiederum notwendig, der Zelle beizubringen, verschiedene Arten von Transport-RNA (tRNA) zu produzieren, die diese Codons erkennen können.
Die tRNA-Moleküle erfüllen die folgende Funktion. Sie tragen wie Lastwagen an einem Ende eine bestimmte Aminosäure, nähern sich der mRNA in den Ribosomen und beginnen wiederum, das Triplett der Nukleotide am anderen Ende mit dem Codon abzugleichen. Wenn sie übereinstimmen, wird die Aminosäure abgestreift und in das Protein eingebaut. Wenn jedoch keine geeignete tRNA vorhanden ist, wird das Protein nicht synthetisiert, was die Lebensfähigkeit der Zellen negativ beeinflussen kann. Durch die Insertion synthetischer Nukleotide in Gene müssten Wissenschaftler daher Gene schaffen, die neue tRNAs codieren, die künstliche Codons erkennen und die richtige Aminosäure an das Polypeptid binden können. Die Aufgabe der Forscher war jedoch einfacher. Sie mussten sicherstellen, dass sich das Plasmid mit synthetischen Nukleotiden erfolgreich vermehrt und an Tochterorganismen weitergegeben wird.
Plasmide zur Transformation von Escherichia coli
Bild: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Natur / Department of Chemistry / The Scripps Research Institute
Dieses als pINF bezeichnete Plasmid wurde in E. coli eingeführt. Um es zu kopieren, ist es jedoch notwendig, dass viele Nukleotide in der Bakterienzelle vorhanden sind. Zu diesem Zweck wurde ein anderes Plasmid, pCDF-1b, in E. coli inseriert. Es enthielt das Gen für die Kieselalge Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, die das NTT-Protein codiert, das Nukleotide vom Nährmedium in die Zelle transportiert.
Wissenschaftler standen jedoch vor einer Reihe von Schwierigkeiten. Erstens haben die Proteine von Phaeodactylum tricornutum eine toxische Wirkung auf die E. coli-Zelle. Alles wegen des Vorhandenseins eines Fragments der Aminosäuresequenz, das eine Signalfunktion trägt. Dank ihr nimmt das Protein die richtige Position in der Algenzelle ein, wonach die Sequenz entfernt wird. E. coli kann dieses Fragment nicht entfernen, daher haben die Forscher ihr geholfen. Sie konnten die ersten 65 Aminosäuren aus NTT entfernen. Dies verringerte die Toxizität signifikant, obwohl es auch die Geschwindigkeit des Nukleotidtransports verringerte.
Ein weiteres Problem bestand darin, dass synthetische Nukleotide lange Zeit in Plasmiden zurückgehalten und beim Kopieren der DNA nicht ersetzt wurden. Wie sich herausstellte, hing ihre Sicherheit davon ab, welche Nukleotide sie umgaben. Um dies herauszufinden, analysierten die Wissenschaftler verschiedene Kombinationen, die in 16 Plasmide eingebettet waren. Um zu verstehen, ob ein synthetisches Nukleotid aus der Sequenz herausgefallen war, verwendeten die Forscher die CRISPR / Cas9-Technologie.
CRISPR / Cas9
Bild: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 ist ein molekularer Mechanismus, der in Bakterien vorhanden ist und es ihnen ermöglicht, Bakteriophagen zu bekämpfen. Mit anderen Worten, diese Technologie repräsentiert die Immunität gegen Virusinfektionen. CRISPR sind spezielle DNA-Abschnitte. Sie enthalten kurze Fragmente von DNA-Viren, die einst die Vorfahren der heutigen Bakterien infizierten, aber durch ihre innere Abwehr besiegt wurden.
Wenn der Bakteriophage in die Bakterien eindringt, werden diese Fragmente als Matrize für die Synthese von Molekülen verwendet, die als crRNA bezeichnet werden. Es werden viele verschiedene RNA-Ketten gebildet, die an das Cas9-Protein binden, dessen Aufgabe es ist, die DNA des Virus zu schneiden. Er kann dies nur tun, nachdem crRNA ein komplementäres Fragment viraler DNA gefunden hat.
Wenn anstelle von crRNA eine zu einem bestimmten Fragment des Plasmids komplementäre RNA-Sequenz verwendet wird, schneidet Cas9 auch das Plasmid. Wenn dieses Fragment jedoch synthetische Nukleotide enthält, funktioniert das Protein nicht. Somit ist es unter Verwendung von CRISPR möglich, jene Plasmide zu isolieren, die gegen unerwünschte Mutationen resistent sind. Es stellte sich heraus, dass in 13 von 16 Plasmiden der Verlust synthetischer Nukleotide unbedeutend war.
Auf diese Weise gelang es den Forschern, einen Organismus mit grundlegenden Veränderungen in der DNA zu schaffen, der sie auf unbestimmte Zeit in sich behalten kann.
Obwohl eine halbsynthetische Lebensform nur zwei unnatürliche Nukleotide in ihrem Genom enthält, die nicht in Codons gefunden werden und nicht an der Codierung von Aminosäuren beteiligt sind, ist sie der erste resistente Organismus, dessen DNA-Alphabet aus sechs Buchstaben besteht. In Zukunft werden Wissenschaftler diese Innovation höchstwahrscheinlich nutzen können, um Proteine zu synthetisieren und so einen vollwertigen künstlichen genetischen Code zu erstellen.
Alexander Enikeev