Die Erfindung des CRISPR-Cas-Geneditors wird als Revolution in der Biologie bezeichnet. Wissenschaftler versprechen, damit Pflanzensorten und Tierrassen für die Landwirtschaft zu verbessern und angeborene Erbkrankheiten beim Menschen zu behandeln. Der RIA Novosti-Korrespondent ging, um zu sehen, wer und wie das Genom bearbeitet wird.
Das Genom-Bearbeitungszentrum der Moskauer Staatlichen Universität wurde vor etwas mehr als einem Jahr auf dem Campus eröffnet. Ich werde von seinem Direktor, Doktor der Chemie Peter Sergiev, getroffen, und während wir im Aufzug fahren, widmet er sich ein wenig der Geschichte der Gentechnik.
„Das Genom wurde bereits zuvor bearbeitet. Nur war es schwierig, Werkzeuge dafür zu entwickeln, es hat lange gedauert und das Ergebnis war oft nicht so, wie wir es wollten “, sagt er.
Im Vivarium zieht sich Pjotr Wladimirowitsch blaue Laborkleidung an, sie geben mir einen weißen Einwegoverall und bitten mich, die Kamera mit Alkohol abzuwischen. Jetzt sieht Petr Vladimirovich aus wie ein Chirurg, und ich - wie ein Laborassistent aus der Serie "CSI - Crime Scene".
Im sterilen Labor wurden für uns ein Behälter mit befruchteten Mauseiern und ein Reagenzglas mit RNA-Lösung vorbereitet. Das ist alles, was Sie für die Bearbeitung des CRISPR-Cas-Genoms benötigen.
CRISPR ist ein englisches Akronym für eine Phrase, die wörtlich "regelmäßig gruppierte kurze palindromische Wiederholungen" bedeutet. Tatsächlich sind dies nur kleine Abschnitte der DNA von Bakteriophagenviren, die in das Bakteriengenom eingebettet sind. Diese Sequenzen werden benötigt, damit das bakterielle Immunsystem funktioniert und als eine Art "polizeilich gesuchte" Ankündigung dient. Wenn das Bakterium nach einer Infektion mit einem Bakteriophagen überlebt, schneidet es mit den Cas-Proteinenzymen ein Stück seiner DNA und fügt es in sein Genom ein, um später erkannt zu werden. Das Bakteriengenom erbt diese Bibliothek von "Feinden", die von früheren Generationen sorgfältig gesammelt wurden.
Im Jahr 2013 fanden Wissenschaftler heraus, dass das Cas-Protein in jedem Organismus, einschließlich Säugetieren, wirkt. Er ist in der Lage, Richtungsbrüche in beiden Strängen des DNA-Moleküls zu machen und so das Genom zu verändern.
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Eimanipulation
Petr Sergiev stellt in der Mikroschmiede eine Glaskapillare mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern her, zieht ein Ei hinein und überträgt es mit einem Nährmedium unter Glas. Die fertige Probe wird zum Tisch des optischen Mikroskops geschickt. Der Monitor zeigt ein vergrößertes Bild des Eies an, das an der Spitze der Kapillare zittert. Zwei abgerundete Flecken fallen auf - dies sind Vorkerne mit der DNA von Mutter und Vater.
Der Wissenschaftler bereitet eine weitere Kapillare mit einem um eine Größenordnung kleineren Durchmesser vor. Dies ist eine Injektionsspritze. Es sammelt eine Lösung mit zwei Arten von RNA und durchbohrt mit Hilfe von Manipulatoren sanft das Ei. Das war's, die Injektion ist fertig.
In das Ei injizierte RNA wird benötigt, um das Genom an einer bestimmten Stelle zu schneiden. Ein RNA-Typ enthält eine streng definierte Sequenz von Nukleotiden, ähnlich der, die wir ändern wollten. Die Aufgabe dieser RNA ist es, die entsprechende Region in der DNA zu finden, daher wird sie "Leitfaden" genannt. RNA des zweiten Typs, Matrix, ist eine Art Anweisung für die Synthese des Cas9-Nukleaseproteins. Dieses Protein wirkt als Katalysator für eine chemische Reaktion, bei der Phosphodiesterbindungen zwischen genau definierten DNA-Basen aufgebrochen werden. Da das Proteinmolekül zwei Nukleasezentren aufweist, werden darüber hinaus beide DNA-Stränge an der Stelle geöffnet, deren Koordinaten Cas9 mit der Leit-RNA "gezählt" hat.
Das DNA-Molekül nimmt den Bruch in beiden Strängen als ernsthaften Zusammenbruch wahr und versucht, ihn zu reparieren. In der Zelle schwimmende Exonukleaseenzyme entfernen sofort mehrere Nukleotide an beiden Enden der Pause. Dies reicht aus, um ein Gen zu brechen oder, wie Genetiker sagen, „auszuschalten“.
Funktionsweise des genomischen CRISPR-Cas9-Editors / Illustration von RIA Novosti. Alina Polyanina.
Wenn beispielsweise eine gerichtete Mutation benötigt wird, um ein Protein zu markieren, um es im Körper zu verfolgen, wird dem Komplex eine weitere Matrize in Form einer speziell entworfenen DNA zu zwei RNAs hinzugefügt. Es besteht aus Sequenzen, die mit den Rändern der zukünftigen Unterbrechung identisch sind, und enthält auch den einzufügenden Abschnitt. Nachdem Cas9 das DNA-Molekül geschnitten hat, werden seine Enden mithilfe dieser zusätzlichen Matrize verbunden, sodass der benötigte Satz von Nukleotiden in die Pause eingefügt wird.
„Wir können dem Eichhörnchen einen kleinen Schwanz anbringen, mit dem es bequem herausgezogen werden kann, um zu sehen, mit was es interagiert. Wir können ein Gen einfügen, aber es ist nicht so effektiv wie das Ausschalten “, erklärt der Wissenschaftler weiter.
GVO und Chimären
Das bearbeitete Ei wird in die Gebärmutterröhre einer Ersatzmaus transplantiert. Sie lebte einige Zeit mit einem Mann zusammen, dessen Samenkanälchen gebunden waren. Das Paar hatte ein normales Sexualleben, konnte es sich aber nicht vorstellen. Trotzdem glaubte der Körper der Maus, dass sie schwanger war, und bildete den geeigneten hormonellen Hintergrund für sie. Jetzt trägt diese Frau den Fötus eines anderen.
In drei Wochen wird sie die gewöhnlichsten Mäuse zur Welt bringen. Die Wissenschaftler werden warten, bis die Nagetiere erwachsen sind, ihnen ein kleines Stück ihres Schwanzes abnehmen und das von ihnen bearbeitete DNA-Stück mittels PCR analysieren. In mehr als der Hälfte der Fälle findet sich eine Mutation oder ein behindertes Gen. Das umgekehrte Verfahren - Insertion einer Sequenz in das Genom - ist in nicht mehr als 10% der Experimente erfolgreich.
Beim Bearbeiten erscheinen verschiedene interessante Effekte. Beispielsweise werden Mosaikmäuse oder Chimären geboren, die Zellen mit unterschiedlichen Variationen des mütterlichen und väterlichen Genoms aufweisen. Cas9 kann DNA viele Male schneiden, aber die dafür kodierende Messenger-RNA ist nicht ewig, und die injizierte Lösung verschwindet einfach in einer Reihe von Zellteilungen. Manchmal feuert der Editor immer noch, nachdem die Vorkerne verschmolzen sind und das Ei geteilt hat. Und da die DNA-Reparatur nach einem Bruch immer ein zufälliger Prozess ist und die Heilung niemals auf die gleiche Weise erfolgt, enthalten einige der Zellen in einem Organismus eine andere Mutation.
Für Wissenschaft und Medizin
Wir ziehen in den angrenzenden Raum, um die Live-Ergebnisse der Genom-Editing-Experimente zu sehen. Links in den Regalen - rechts Behälter mit gentechnisch veränderten Mäusen - mit gewöhnlichen Nagetieren zur Kontrolle. Sie wurden wie die linken gezüchtet, aber das Genom wurde nicht manipuliert. Kontrollmäuse werden benötigt, um eine Norm vor Augen zu haben und die im Experiment erhaltenen Kreaturen damit zu vergleichen.
Pjotr Sergjew nimmt einen der Behälter mit einem Paar grauer Mäuse. Äußerlich sind sie ganz normal, aber sie haben keine Nachkommen. Tatsache ist, dass beim Mann das Gen einer der RNA-Methyltransferasen, eines Enzyms, das nur in Spermien produziert wird, ausgeschaltet ist. Männer mit einem inaktiven Gen werden steril geboren. Der genaue Zweck des Gens und des Enzyms ist noch unbekannt. Um dies herauszufinden, wurden zwei Mäusestämme im Labor gezüchtet: Einer hatte ein ausgeschaltetes Gen, der andere hatte ein Protein, das mit einem genomischen Editor markiert war.
„Eine Mutation in diesem Gen findet sich auch beim Menschen - dann leidet ein Mann an Unfruchtbarkeit. Aber bis wir herausfinden, warum es benötigt wird, warum es RNA modifiziert, werden wir solchen Patienten nicht helfen können “, begründet der Wissenschaftler.
Tatsächlich kennen wir die Funktion der meisten menschlichen Gene immer noch nicht. Dies herauszufinden ist eine grundlegende Aufgabe, die von vielen Forschungsgruppen auf der ganzen Welt, auch in Russland, gelöst wird. Das Mausgenom ist dem des Menschen sehr ähnlich. Es ist zu hoffen, dass mit Hilfe von CRISPR-Cas die Untersuchung des Genoms einer Kreatur schneller vonstatten geht.
Sergievs Gruppe zusammen mit N. N. NN Petrova machte sich auf die Suche nach Mutationen, die zu bestimmten Krebsarten führen. Die nächsten Pläne beinhalten ein Projekt zur Schaffung gentechnisch veränderter Tiere für die Landwirtschaft in Zusammenarbeit mit dem Allrussischen Forschungsinstitut für Tierhaltung und dem Institut für Genbiologie der Russischen Akademie der Wissenschaften.
„CRISPR-Cas ist ein fantastisches Werkzeug, mit dem Sie das Genom nach eigenem Ermessen ändern können, um ein bisschen von Gott zu sein. Letztendlich besteht die Aufgabe der Wissenschaft darin, zu verstehen, wie eine so komplexe Kreatur wie ein Säugetier funktioniert “, sagt der Wissenschaftler.
Die Lösung grundlegender Probleme der Wissenschaft ist großartig, aber was wird diese Technologie der Medizin bringen? In absehbarer Zeit leider nicht viel. Es ist einfach, ein Ei zu bearbeiten und eine gentechnisch veränderte Maus aufzuziehen, aber es ist unmöglich, die Gene eines erwachsenen Tieres zu korrigieren, geschweige denn eines Menschen.
Methoden zur Bearbeitung von DNA in somatischen (dh bereits gebildeten Zellen) sind immer noch sehr unwirksam. Um in eine Zelle ein durch Mutation ausgeschaltetes Gen einzuführen und es zur Produktion eines bestimmten Proteins zu zwingen, müssen Sie einige der Zellen aus dem Körper entfernen, die darin enthaltene DNA bearbeiten und sie wieder in den Körper einbringen. Grundsätzlich besteht die Hoffnung, dass auf diese Weise Krankheiten wie Duchenne-Muskeldystrophie oder Mukoviszidose bekämpft werden können, wenn die Arbeitsfähigkeit eines Teils der Zellen wiederhergestellt werden muss. Was die Veranlagung zu Krebs betrifft, so ist der Genom-Editor bisher machtlos. Wenn ein mutiertes Gen in einer Person gefunden wird, wird es in allen Körperzellen gefunden. Es ist unrealistisch, alle zu ändern. Und jede Zelle mit einer Mutation ist eine Gefahrenquelle.
Aber selbst wenn CRISPR / Cas dazu beitragen wird, nur einige grundlegende Fragen zu beantworten und die Behandlung seltener genetischer Krankheiten zu ermöglichen, wird dies für die Menschheit immer noch ein großer Fortschritt sein.
Tatiana Pichugina