Proben von Mumiengeweben unter den Namen "Maria" und "Vavita" wurden aus Peru zur Forschung an ein russisches Labor geschickt. Die bereitgestellten Proben von biologischen Geweben wurden unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, Raman-Spektren, ICPE untersucht, und die Zusammensetzung von Kieselgur (eine Substanz auf der Hautoberfläche von Mumien) wurde untersucht. Eine Untersuchung der DNA der übertragenen Gewebe wurde ebenfalls durchgeführt.
Probenvorbereitung
Gewebeproben von jeweils 500 & mgr; g wurden in Kunststoffröhrchen überführt und in 1 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl) gelöst. Zu den resultierenden Suspensionen wurde Na-Dodecylsulfat zu 0,5% gegeben, auf +80 ° C erhitzt und nach 10 Minuten wurde Proteinase K (bis zu 500 & mgr; g / ml) für 24 Stunden in einen Thermostat (+55 ° C) gegeben.
Die Deproteinisierung wurde nach der Phenolmethode durchgeführt: Zugabe von Phenol in gleichem Volumen zur Suspension, dann Phenol: Chloroform (1: 1), Chloroform; Nach jeder Zugabe wurde ein ständiges Rühren an einem Winkelrotor durchgeführt und 10 min bei 15.000 U / min zentrifugiert.
Zu dem nach der 3. Zentrifugation erhaltenen Supersediment wurde 1/10 des Volumens von 1 M NaCl und 2,5 Volumen von zweimal destilliertem Ethylalkohol gegeben und über Nacht bei -30ºC in konischen Reagenzgläsern - "Eppendorf" - belassen. Die Zentrifugation wurde bei 15 Tausend Vol.-% durchgeführt. Mindest. innerhalb von 10 Minuten und erhielt DNA "ausgefällt" in Form eines braunen Niederschlags. Das DNA-Pellet wurde zweimal mit 70% igem Ethylalkohol gewaschen und bei Raumtemperatur (1 h) getrocknet und dann in TE-Puffer gelöst.
Die PCR wurde an einem programmierbaren Thermocycler "My Cycler" ("Bio = Rad") unter Verwendung von Standard-Oligoprimeren durchgeführt, die nach der Festphasenmethode bei der Vereinigung "Beagler" (St. Petersburg) synthetisiert wurden. Das Reaktionsgemisch zur Amplifikation mit einem Volumen von 25 & mgr; l enthielt: 15 nM jedes Oligoprimers, 67 mM Tris-HCl, pH = 8,8 bei +25 ° C, 16,6 mM (NH 4) SO 4, 6,7 mM MgCl 2, 6,7 & mgr; M EDTA, 10 mM 2 Mercaptoethanol, 170 & mgr; g / ml BSA und eine Mischung aus vier basischen dNTPs in einer Konzentration von jeweils 1,0 mM und thermostabiler DNA-Polymerase Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Nach Denaturierung (10 min, 94 ° C) wurden 35 Amplifikationszyklen für jedes Testsystem durchgeführt: 94 ° C –1 min, 58 ° C –1 min, 72 ° C –1 min. Zur Kontrolle der Spezifität wurden DNA-Proben mit bekannten Genotypen für die untersuchten Loci (Markersysteme) sowie Kontrollproben in die Reaktion eingeführt.enthält eine Mischung von Reagenzien ohne DNA. Nach der Amplifikation wurde ein Färbepuffer zu Aliquots des Reaktionsgemisches (7 & mgr; l) gegeben und durch vertikale Elektrophorese in 6% Polyacrylamidgel (210 × 150 × 1 mm) getrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter ultraviolettem Licht fotografiert. Um Allele zu identifizieren, wurden Allelstandards verwendet, die diesen Loci entsprechen ("Leitern").
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DNA-Analyse
Für die Studie verwendeten wir die Methode der Exomanalyse menschlicher DNA basierend auf Hochdurchsatzsequenzierung mit Anreicherung durch Hybridisierung.
Technik der Exomanalyse menschlicher DNA.
2 Proben wurden analysiert … Alle Stufen der Probenvorbereitung vor der PCR wurden in Reinräumen durchgeführt. Probenvorbereitung, DNA-Extraktion und Amplifikation einzelner DNA-Fragmente wurden in verschiedenen Räumen durchgeführt.
Spezifische Adapter (KAPA Library Preparation Kit und SeqCap Adapter Kit; Roche) wurden an die Enden der genomisch fragmentierten DNA (~ 5 ng) ligiert, wonach eine zweistufige Auswahl von Fragmenten im Längenbereich von 200 bis 350 bp unter Verwendung von AMPureXP Beads (Beckman Coulter) durchgeführt wurde. … Die resultierenden Fragmente wurden unter Verwendung von adapterspezifischen Primern amplifiziert und mit biotinylierten spezifischen Sonden (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) 28 Stunden lang bei 47 ° C hybridisiert. In einer Reaktion wurden zwei DNA-Proben kombiniert. Biotinylierte Sonden-DNA-Hybride wurden isoliert und mit Streptovidin-konjugierten Magnetpartikeln gereinigt, eine zweite Amplifikation und qualitative Bewertung der resultierenden DNA-Bibliothek wurde durchgeführt (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Um Amplifikationsfragmente und Adapterdimere außerhalb des Ziels zu entfernen, wurde die DNA-Bibliothek unter Verwendung von AMPureXP Beads-Magnetpartikeln erneut gereinigt (1). Die Endkonzentration der hergestellten Bibliothek wurde auf einem Quantus-Instrument unter Verwendung eines kommerziellen QuantiFluor® dsDNA-Systemkits (Promega) bewertet. Die resultierende DNA-Bibliothek wurde auf der Oberfläche der Durchflusszelle immobilisiert. Die Sequenzierung wurde auf der Illumina-Plattform unter Verwendung einer Standard-Durchflusszelle und eines MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 Zyklen) durchgeführt. Die resultierende DNA-Bibliothek wurde auf der Oberfläche der Durchflusszelle immobilisiert. Die Sequenzierung wurde auf der Illumina-Plattform unter Verwendung einer Standard-Durchflusszelle und eines MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 Zyklen) durchgeführt. Die resultierende DNA-Bibliothek wurde auf der Oberfläche der Durchflusszelle immobilisiert. Die Sequenzierung wurde auf der Illumina-Plattform unter Verwendung einer Standard-Durchflusszelle und eines MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 Zyklen) durchgeführt.
Zahl: 1
Allgemeine Bewertung der Qualität der sequenzierten DNA
Für die anfängliche Qualitätsbewertung wurden Standardmethoden wie FastQC sowie die Programme Jellyfish und KraTER verwendet. Die Qualitätsbewertung ergab keine Qualitätsprobleme mit den sequenzierten DNA-Reads für beide Proben. Bilder werden nicht angezeigt, da sie nicht informativ sind.
Für die erste Probe (weitere M, große Mumie "Maria") wurden 113,4 M Lesevorgänge sequenziert, für die zweite Probe (weitere W, kleine Mumie "WaWita") wurden 22,9 M Lesevorgänge sequenziert.
Der nächste Schritt bestand darin, die sequenzierten Lesevorgänge von verschiedenen technischen Sequenzen zu reinigen, die die weitere Analyse stören würden. Hierzu wurde das Cookiecutter-Programm verwendet. Nach dem Reinigen wurden für M und W 113,3 M (99%) bzw. 22,8 M (99%) gelesen.
Abschätzung der Menge an alter DNA und ihrer Trennung von der modernen
Die Standardmethode zur Beurteilung des Vorhandenseins und der Menge alter DNA besteht darin, die Menge zeitgeschädigter Nukleotide abzuschätzen. Hierzu wurde das Programm MapDamage 2.0 verwendet. MapDamage 2.0, das die Menge an alter DNA in 30,1% zeigte, aber da MapDamage impliziert, dass wir eine enge Referenz verwenden und wir nicht genau wissen, wie nahe beide Proben am Genom des modernen Menschen liegen, und wir eine Exombibliothek verwendeten, war diese Methode selbst nicht ausreichend. Eine weitere gute Methode zur Beurteilung der alten DNA ist die Anzahl der kurzen Fragmente.
Die Filtration der angeblichen alten DNA erfolgte in drei Schritten. In der ersten Phase haben wir alle gepaarten Lesevorgänge entfernt, die nicht gekreuzt werden können, und zu einem ungepaarten Lesevorgang mit Überlappung zusammengefasst. Diese Lesevorgänge zeigten an, dass das ursprüngliche Fragment, das sequenziert wurde, länger als 300 bp war. und höchstwahrscheinlich moderne DNA. Nach diesem Schritt blieben also 86,9% bzw. 91,8% übrig. Danach wurden einzelne überlappende Fragmente so ausgewählt, dass ihre Länge kürzer als 150 bp war, da dies die Länge ist, die wir für alte DNA erwartet hatten. Nach diesem Schritt blieben 8,6% bzw. 38,5% für die Proben M und W. Es ist zu beachten, dass trotz des prozentualen Unterschieds die absolute Anzahl der Lesevorgänge zwischen den Proben M und W sehr ähnlich ist: 9,8 M und 8,8 M, was durch die Tatsache erklärt werden kann, dass Der Gehalt an alter DNA in beiden Proben ist ähnlich.
| Parameter | Probe M (Maria) | Probe W (Wawita) |
| Anzahl der Lesevorgänge | 113,3 M. | 22,8 M. |
| Prozentsatz der kurzen Fragmente <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Prozentsatz der kurzen Fragmente <150 bp (Anzahl) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813 220) |
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Prozentsatz der Fragmente, die pro menschlichem Genom ausgerichtet sind (Anzahl) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264.551) |
| Prozentsatz der pro menschlichem Genom ausgerichteten Fragmente von kurz <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Erhalten von DNA ähnlich dem menschlichen Referenzgenom
Die resultierende mutmaßliche alte DNA wurde unter Verwendung einer Standard-Suchpipeline für genomische Varianten unter Verwendung von BWA, Samtools und Wcftools auf ein menschliches Referenzgenom abgebildet.
Darüber hinaus wurden nur 23,8% der Probe M und 25,6% erfolgreich auf das Referenzgenom des modernen Menschen abgebildet. Gleichzeitig konnten für beide Proben 75% der sequenzierten Lesevorgänge nicht auf das menschliche Genom abgebildet werden. Dies kann sowohl durch Kontamination als auch durch die Tatsache erklärt werden, dass diese Proben weit genug vom Genom des modernen Menschen entfernt sind. Gleichzeitig ist zu beachten, dass wir die Exombibliothek sequenziert und dadurch die Kontamination der bakteriellen DNA minimiert haben.
Erste Aufklärungsanalysen von ungekochten Messwerten zeigten, dass einige von ihnen zu repetitiver DNA gehörten, die für Huftiere spezifisch ist. Dies kann durch die Tatsache erklärt werden, dass Lama-Fett zur Mumifizierung verwendet wurde.
Eine detailliertere Analyse erfordert etwa drei Wochen Berechnungen, da die vorhandenen Lösungen nur für virale und bakterielle Genome erstellt werden und wir mit allen vorhandenen Genomen, einschließlich Pflanzengenomen, vergleichen müssen, um zu verstehen, welche Arten sequenziert wurden.
Eigenschaften der gefundenen Optionen
Die kartierten Lesevorgänge wurden verwendet, um nach Varianten zu suchen, die M- und W-Proben vom modernen menschlichen Genom unterscheiden, sowie um die Kontamination von Lesevorgängen vom menschlichen Y-Chromosom zu bewerten.
Die erste Frage, die beantwortet werden musste, war, auf welche Chromosomen die sequenzierten Reads abgebildet wurden.
Da wir wissen, dass Marias Proben aus Knochen und Muskeln isoliert wurden und Vavitas nur aus Knochen, erwarteten wir einen Unterschied in der Menge an mtDNA. Aber es gab keinen großen Unterschied.
Die Anzahl der auf Y abgebildeten Lesevorgänge ist ein weiterer Test für die Kontamination durch moderne Menschen. Interessanterweise stellte sich heraus, dass es in beiden Proben gleich war.
Die Statistiken für die gefundenen Varianten sind unten aufgeführt:
| Parameter | Probe M (Maria) | Probe W (Wawita) |
| Anzahl der gefundenen Optionen | 79957 | 48941 |
| Anzahl der Optionen auf Y. | 534 | 541 |
| Die Anzahl der zuverlässigen Optionen (mehr als 20 Lesevorgänge und mehr als 30 Qualität) | 16969 | 6181 |
| Varianten mit bekannter Rsid (verfügbar in der Snip-Datenbank) | 5701 | 3089 |
| Allgemein gültige Optionen | 92 | |
| gemeinsame Optionen mit rsid | 49 |
Danach wurde es möglich, die Frage zu beantworten: Sind M und W Verwandte? Die Antwort ist nein.
Es wurden nur 49 übereinstimmende Varianten zwischen M und W und 3040 gefunden, die sich für Varianten mit bekannter Rsid unterschieden. Darüber hinaus sind dies möglicherweise verschiedene Arten oder Unterarten einer Person oder einer unbekannten Kreatur.
Interessanterweise sind die Varianten mit dem Y-Chromosom für beide Proben identisch, was auf eine Kontamination durch dieselbe Person hinweist, und dass in der alten DNA des Y-Chromosoms wahrscheinlich kein Chromosom vorhanden ist.
Bewertung der Ähnlichkeit mit den vorhandenen sequenzierten menschlichen Genomen aus dem 1000 Human Genome Project
Beachten Sie, dass dies nur eine ungefähre Analyse ist, da für eine genauere Analyse Varianten aus Regionen des Genoms unter neutraler Selektion benötigt werden und wir Exomdaten haben.
Trotzdem war es mit 5708 Varianten für M oder 3096 für S möglich, eine Variante der Analyse im Vergleich zu den Daten von 1000 menschlichen Genomen durchzuführen.
Das Ergebnis der PCA-Analyse im folgenden Bild ist eine Überlagerung von zwei Bildern für M und W, die separat berechnet werden, da es zwischen M und W zu wenige gemeinsame Optionen gibt, um die Abstände zwischen M und W abzuschätzen.
Ähnlichkeitsbewertung.
Wie Sie sehen können, gibt es keinen Zufall mit einer Gruppe von Genen, sie unterscheiden sich auch voneinander. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass wir Codierungssequenzen unter Auswahl verwendet haben, und es wird empfohlen, Varianten unter neutraler Auswahl zu verwenden.
Trotzdem stimmt das PCA-Ergebnis gut mit der manuellen Überprüfung von Varianten überein, was zeigte, dass sich die Daten in einer nicht referenzierten Homozygote befinden, was wiederum darauf hinweist, dass die Bilder weit vom modernen menschlichen Genom entfernt sind.
Fazit
Leider waren wir auf nur zwei Proben beschränkt, normalerweise werden bei dieser Art der Analyse mehr verwendet, mindestens 3-10 zumindest irgendwie verwandt. Daher ist es notwendig, die Forschung mit einer großen Anzahl von Proben fortzusetzen.
Gleichzeitig können wir höchstwahrscheinlich den Schluss ziehen, dass die DNA-Proben von Mary und Vavita der menschlichen DNA entsprechen, jedoch nicht mit der DNA übereinstimmen, die uns aus einer Datenbank von 1000 Personen zur Verfügung steht.
Autoren des Berichts: Baranov V. S. und Aseev M. V. (Wissenschaftliches Forschungsinstitut für Geburtshilfe und Gynäkologie, Abteilung für Pränataldiagnostik), Glotov A. S. und Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Institut für Zytologie, Russische Akademie der Wissenschaften, Zentrum für Genetische Bioinformatik).
Materialien zur Verfügung gestellt von Konstantin Georgievich Korotkov (Doktor der Technischen Wissenschaften, Professor, Universität für Informationstechnologien, Mechanik und Optik) und Dmitry Vladislavovich Galetsky (Kandidat der medizinischen Wissenschaften, I. P. Pavlov Erste Staatliche Medizinische Universität St. Petersburg).
Weitere Informationen zu Nazca-Mumien finden Sie unter dem Tag: Nazca-Mumien.
