Wissenschaftler setzen große Hoffnungen auf die CRISPR / Cas9-Technologie, die hochpräzise Veränderungen im Genom lebender Organismen, einschließlich des Menschen, ermöglicht. Alle neuen wissenschaftlichen Artikel werden veröffentlicht, in denen verschiedene Arten von CRISPR-Systemen sowie deren Modifikationen beschrieben werden. "Lenta.ru" spricht über die Entdeckungen in diesem Bereich, die 2016 gemacht wurden.
Tausende von ihnen
CRISPR / Cas9 ist ein bakterielles adaptives Immunsystem, mit dem Mikroorganismen Viren bekämpfen können. Es besteht aus Spacern - DNA-Schnitten, die bestimmten Fragmenten (Protospacern) der DNA des Infektionserregers entsprechen. Die Spacer codieren spezifische crRNA-Moleküle, die an das Cas9-Enzym binden. Der resultierende Komplex bindet an die DNA-Kette des Virus und Cas9 funktioniert wie eine Schere und schneidet sie.
Tatsächlich ist CRISPR / Cas9 nur eines von vielen ähnlichen Systemen, über die Bakterien und Archaeen verfügen. Wissenschaftler teilen sie in zwei Klassen ein. Die erste Klasse umfasst CRISPR-Systeme der Typen I, III und IV und die zweite - II und V. Typ II enthält das Cas9-Protein, das an der Akquisition neuer Spacer, der Akkumulation von crRNA in der Zelle und der DNA-Spaltung beteiligt ist. In anderen Systemen werden für diese Zwecke Multiproteinkomplexe verwendet. Dies macht Typ II zum einfachsten Typ eines CRISPR-Systems, das für gentechnische Anforderungen geeignet ist.
Typen können wiederum in Subtypen unterteilt werden, je nachdem, welche zusätzlichen Gene mit CRISPR assoziiert sind. Beispielsweise enthalten IIA-Systeme das csn2-Gen, das ein Protein codiert, das an DNA bindet und an der Akquisition von Spacern beteiligt ist. In IIB-Systemen fehlt csn2, aber es gibt ein cas4-Gen, dessen Funktion noch unbekannt ist, und IIC-Systeme haben weder csn2 noch cas4.
Schätze in Bakterien
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Alle bekannten CRISPR-Systeme wurden von Wissenschaftlern in Bakterien entdeckt, die unter Laborbedingungen gezüchtet wurden. Es gibt jedoch eine große Anzahl nicht kultivierter Mikroorganismen, zu denen sowohl Archaeen als auch Bakterien gehören. Sie leben normalerweise unter extremen Bedingungen - Mineralquellen oder giftige Gewässer in verlassenen Minen. Forscher können jedoch DNA aus ihnen isolieren und bestimmte Regionen darin identifizieren. In einem neuen Artikel, der am 22. Dezember in Nature veröffentlicht wurde, entschlüsselten Genetiker der University of California in Berkeley Genome aus natürlichen mikrobiellen Gemeinschaften und entdeckten andere Variationen des CRISPR-Systems.
Bakteriophage - ein Virus, das Bakterien infiziert
Bild: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Den Wissenschaftlern gelang es herauszufinden, dass einige Arten von wenig untersuchten archeähnlichen Nanoorganismen ARMAN auch CRISPR / Cas9 besitzen, obwohl zuvor angenommen wurde, dass nur Bakterien sie haben. Es wird angemerkt, dass dieses System einen Zwischenplatz zwischen den Subtypen IIC und IIB einnimmt und als Verteidigung gegen parasitäre "springende" Gene (Transposons) dienen kann, die von anderen Archaeen in den Mikroorganismus eindringen. Ein Versuch, die Aktivität von archaealem CRISPR / Cas9 in E. coli (Escherichia coli) zu reproduzieren, führte zu nichts, was auf die Existenz einiger zusätzlicher spezifischer Mechanismen hinweist, die das System regulieren.
Neue Arten von Systemen der zweiten Klasse, CRISPR / CasX und CRISPR / CasY, wurden ebenfalls aus Bakterien isoliert, die in Grundwasser und Sedimenten leben. Das CRISPR / CasX-System umfasst die Proteine Cas1, Cas2, Cas4 und CasX. Letzteres zeichnet sich, wie Experimente an E. coli zeigen, durch Nukleaseaktivität aus, dh es ist in der Lage, fremde DNA wie Cas9 zu spalten. Dies geschieht jedoch nur, wenn sich die TTCN-Sequenz vor den Protospacern befindet, wobei N eines der vier Nukleotide ist. Solche Sequenzen werden PAM (Protospacer-Nachbarmotiv - Motiv neben dem Protospacer) genannt. Das CRISPR / Cas9-System verfügt auch über ein eigenes PAM-NGG, das sich hinter dem Protospacer befinden sollte. Darüber hinaus kann CRISPR / CasY DNA schneiden, wenn sich in der Nähe der Zielstelle eine TA-PAM-Sequenz befindet.
Was verspricht diese Entdeckung? Tatsache ist, dass die erkannten Systeme die derzeit kompaktesten sind. Laut Wissenschaftlern sind CRISPR / CasX und CRISPR / CasY aufgrund der geringen Menge an Proteinen, die für ihre Arbeit benötigt werden, bequeme Werkzeuge für die DNA-Bearbeitung. Darüber hinaus wird die metagenomische Forschung, bei der aus der Umwelt gewonnene DNA untersucht wird, andere Arten von CRISPR-Systemen aufdecken, die für die Gentechnik nützlich sind.
Der Weg zur Exzellenz
Natürlich gibt es eine Alternative zur Suche nach CRISPR-Systemen in der Natur - die Verbesserung der bereits vorhandenen CRISPR / Cas9-Technologie. Trotz ihrer hohen Genauigkeit macht sie Fehler, indem sie DNA an der falschen Stelle schneidet. Dies macht es schwierig, die richtigen Veränderungen in den Genen vorzunehmen und somit Erbkrankheiten wirksam zu behandeln. Daher suchen Wissenschaftler nach Möglichkeiten, um die Leistung des Systems zu verbessern. Im Jahr 2016 gab es viele wissenschaftliche Arbeiten, die sich mit der Modifizierung von CRISPR und der Umwandlung in verschiedene Genwerkzeuge befassten.
Protein Cas9 und crRNA - die Hauptkomponenten des CRISPR-Systems
Bild: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Am 8. Dezember veröffentlichte die Zeitschrift Cell einen Artikel von Wissenschaftlern der University of Toronto, die "Anti-CRISPR" entwickelten - ein System, das den Mechanismus unter bestimmten Bedingungen ausschaltet. Auf diese Weise können Sie die Cas9-Aktivität unterdrücken, wenn die Leit-RNA an das falsche Fragment bindet und Fehler verhindert. Anti-CRISPR besteht aus drei Nuklease-inhibierenden Proteinen. Natürlich wurde es ursprünglich nicht von Wissenschaftlern erfunden, sondern von Viren, die so die Immunität von Bakterien neutralisierten.
Im Juni bestätigten amerikanische Forscher zusammen mit Kollegen aus Russland, dass das CRISPR / C2c2-System, das aus dem Fusobakterium Leptotrichia shahii gewonnen wurde, einzelsträngige RNA schneiden kann. Infolgedessen kann das CRISPR-System verwendet werden, um Funktionen der Messenger-RNA auszuschalten - zu unterdrücken -, die Informationen von Genen zu Ribosomen transportiert, wo Proteine auf ihrer Basis synthetisiert werden.
Im Mai entwickelten Forscher der University of California die CRISPR-EZ-Technologie, mit der neue DNA-Moleküle mit fast hundertprozentigem Erfolg in das Genom von Mausembryonen eingefügt werden können. Das CRISPR / Cas9-System wird mit einer mikroskopischen Nadel und einer winzigen elektrischen Entladung in befruchtete Tiereier eingeführt. In ihrem Experiment gelang es den Wissenschaftlern, bei 88 Prozent der Mäuse eine Mutation in ein Gen einzuführen. Dies übersteigt die Anzahl genetisch veränderter Mäuse, die durch CRISPR-Bearbeitung hergestellt wurden, bei der herkömmliche Injektionen verwendet werden.
Im April entwickelten Molekularbiologen der Medizinischen Fakultät der Universität von Massachusetts unter Verwendung einer mutierten Variante von Cas9, der die Nukleaseaktivität fehlt, die CRISPRainbow-Technologie. Die Leit-RNA, die angibt, wo sich die Enzyme anlagern, enthielt fluoreszierende Markierungen, die es beispielsweise ermöglichen, die Bewegung mobiler genetischer Elemente zu verfolgen.
Anopheles-Mücke kann das erste Opfer von CRISPR-Systemen sein
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Schöne neue Welt
Wissenschaftler verwenden bereits CRISPR-Systeme, um genetisch veränderte Organismen wie Malariamücken zu erzeugen, die schädliche Gene unter ihren wilden Verwandten verbreiten. Diese Methode wird als Gen-Drive bezeichnet. Wenn einer der Elternteile eines Individuums Träger eines mutierten Gens war, wird er es mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 Prozent an seine Nachkommen weitergeben. Dies liegt daran, dass der Elternteil zwei Kopien des Gens hat und nur eine davon defekt ist. CRISPR kann ein mutiertes Fragment kopieren und in ein gesundes Gen einfügen. Infolgedessen erhalten die Nachkommen die Mutation mit 100% iger Wahrscheinlichkeit.
Im Jahr 2016 genehmigten Experten des Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) einen Antrag der University of Pennsylvania, Tests zur genetischen Veränderung des Menschen mithilfe der CRISPR / Cas9-Technologie durchzuführen.
Sie wurden jedoch von den Chinesen überholt. Im November berichtete die Zeitschrift Nature, dass chinesische Wissenschaftler erstmals Zellen mit vom CRISPR / Cas9-System modifizierten Genen in den Menschen einführten. Die Forscher extrahierten Immunzellen (T-Lymphozyten) aus dem Blut eines Patienten mit metastasiertem Lungenkrebs und schalteten dann mithilfe der CRISPR-Technologie das für das PD-1-Protein kodierende Gen aus. Es wurde gezeigt, dass letzteres die Immunität unterdrückt, indem es das Tumorwachstum fördert. Wissenschaftler kultivierten die bearbeiteten Zellen, erhöhten ihre Anzahl und injizierten sie dann zurück in den menschlichen Körper. Ob die Gentherapie mit der Krankheit fertig wird, bleibt abzuwarten.
CRISPR-Systeme können auch zur Bekämpfung von HIV und Erbkrankheiten des Menschen eingesetzt werden. Es sind jedoch weitere Forschungsarbeiten erforderlich, um wirksame Behandlungen zu entwickeln. Natürlich sprechen wir nicht wie in Science-Fiction-Filmen über Mutanten, aber Wissenschaftler werden in der Lage sein, schnell genetisch veränderte Organismen zu erzeugen, beispielsweise landwirtschaftliche Pflanzen mit Resistenz gegen Parasiten. Es bleibt abzuwarten, warum die Wissenschaftler, die CRISPR entdeckt und herausgefunden haben, wie es verwendet werden kann, den Nobelpreis noch nicht erhalten haben.
Alexander Enikeev
